PHÒNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định.
Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể cung cấp những lợi thế nhất định so với phương pháp nhân giống truyền thống, bao gồm:
Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng cao hoặc có những tính trạng mong muốn khác.
Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh chóng
Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo hạt.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen.
Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh.
Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm.
Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác và nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp.
I. PHÒNG RỬA, SẤY, HẤP DỤNG CỤ VÀ SẢN XUẤT NƯỚC CẤT
Phòng rửa dụng cụ phải có bồn rửa lớn, có đường thoát nước riêng cho axit, có kệ để các thiết bị, có nguồn cung cấp ga, nước, điện và có thể không khí nén, ống chân không.
Các thiết bị dụng cụ chủ yếu:
1. Máy sản xuất nước khử ion
2. Máy cất nước 1 lần
3. Máy cất nước 2 lần
4. Nồi hấp khử trùng
5. Tủ sấy 300°C (loại có dung tích lớn)
6. Đồng hồ định giờ
7. Các giá kim loại để dựng ống nghiệm khi hấp trong nồi hấp
8. Giấy nhôm hoặc hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử
9. Xà phòng, axit HCl hoặc sulfuric.
10. Máy rửa pipet, các loại chổi cọ rửa.
11. Bồn rửa dụng cụ
II. PHÒNG CHUẨN BỊ VÀ PHA MÔI TRƯỜNG
Các thiết bị, dụng cụ chủ yếu:
1. Tủ chứa hoá chất
2. Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
3. Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
4. Máy đo pH
5. Máy khuấy từ gia nhiệt
6. Tủ lạnh 100-200L
7. Tủ lạnh sâu (-20 đến -80°C)
8. Lò vi sóng hay bếp đun để đun nóng môi trường khi trộn với aga
9. Kính hiển vi soi nổi
10. Kính hiển vi sinh học
11. Bàn để dụng cụ, hóa chất
9. Nếu làm trên quy mô lớn thì cần trang bị thêm: Máy rót môi trường và Máy trộn khi pha lượng lớn môi trường.
Ngoài ra trong phòng còn có:
- Đồng hồ bấm giờ
- Giá đựng ống nghiệm các loại
- Các dụng cụ thuỷ tinh trong suốt
- Bông không thấm nước
- Các dung dịch chuẩn (stock, solutions)
- Màng lọc và giá đơn chịu nhiệt hoặc các phễu lọc thuỷ tinh.
- Các hoá chất diệt khuẩn để xử lý mô thực vật: Calcium hypochlorite, Sodium hypochlorite, nước bromine, H2O2, HgCl2, kháng sinh gồm Rifampicin, các polymicin và vancomycin .
Trong phòng phải có khu vô trùng để chứa môi trường dinh dưỡng, nước khử trùng..
III. PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG (Phòng thao tác)
Phòng cấy vô trùng nên là một phòng nhỏ rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào, kín, sàn và tường cần được lát gạch men hoặc sơn để lau chùi và khử trùng thường xuyên. Cửa phòng cấy nên là cửa kính vì trong khi thao tác cấy rất dễ bị phụt đèn cồn do đó cần phải dễ liên lạc với bên ngoài trong lúc cần thiết.
Trên tường gắn đèn UV để khử trùng phòng.
Các thiết bị, dụng cụ chủ yếu:
Tủ cấy vô trùng (laminar, clean Bench): tủ cấy tĩnh và tủ cấy thổi khí vô trùng. Trong tủ cấy phải có đèn trắng để dễ làm việc và có đèn UV để khử trùng trước khi làm việc
Bộ dụng cụ khử trùng (có thể sử dụng Bể rửa siêu âm)
Quạt thông gió
Đèn tử ngoại treo tường 1,2m hoặc treo trần
Thiết bị lọc khí.
Giá và bàn để môi trường
Bộ dụng cụ kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn, giấy lọc, bình đựng nước cất, đèn cồn (hoặc đèn gas), cốc đựng cồn 90o
Hoá chất xử lý buồng cấy trước khi cấy: fomadehyde (formalin)40%, NH3 25%
Áo choàng, mũ vải, khẩu trang
IV. PHÒNG NUÔI
Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ẩm, độ dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp. Phòng nuôi có nhiệt độ 15 - 30°C tùy theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm. Nhiệt độ phải được phân bố đều trong toàn phòng nuôi, phải có đầy đủ ánh sáng huỳnh quang và có thể điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng. Phòng nuôi phải được thổi khí đồng nhất và biên độ độ ẩm được điều chỉnh từ 20 - 98%.
- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy đo ánh sáng
- Nhiệt ẩm kế
- Kệ nuôi cấy
- Máy lắc nằm ngang 100-200 vòng/phút
- Các thiết bị và dụng cụ nuôi cấy tế bào đơn
- Tủ ấm.
Phòng nuôi sáng: tường nên sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn ống để chiếu sáng. Trong phòng cần gắn các máy móc kiểm tra chính xác nhiệt độ, độ ẩm.
Phòng nuôi tối: để nuôi mô và các xử lí đặc biệt. Phòng cần tất cả các điều kiện như phòng sáng chỉ khác là không cần lắp đèn chiếu sáng cho cây, cửa sổ cần được che kín bằng vải đen.
V. PHÒNG SINH HÓA
Dùng để tiến hành các phân tích chuyên sâu về sinh hóa, sinh học phân tử để thu nhận số liệu phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất. Tùy thuộc vào kinh phí đầu tư và mục đích thí nghiệm mà có thể trang bị thêm các thiết bị hiện đại như:
Kính hiển vi có kết nối máy ảnh kỹ thuật số, camera;
Tủ hút,
Tủ ấm;
Cân các loại;
Máy cắt tiêu bản;
Máy đo pH;
Máy ly tâm lạnh;
Máy PCR,
Máy realtime PCR;
Máy chạy sắc ký;(HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng…)
Máy đo quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm.
Tủ lạnh, Tủ lạnh âm sâu;
Máy điện di, máy soi AND
Pipet các loại
Máy soi và chụp ảnh gel
Các tủ đựng hóa chất, tủ hút khí độc.
VI. HÓA CHẤT
Bên cạnh phòng thí nghiệm cần có hệ thống nhà lưới và vườn ươm để trồng cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và trồng cây tái sinh trong quá trình chọn lọc ìnvitro
Các hóa chất dùng trong nuôi cấy mô
1.Các chất khử khuẩn mô, vệ sinh tủ... (Trung Quốc, Việt Nam):
- Fomadehyde (formalin) 40%, lít 10
- NH3 25% , lít 10
- Acolhol (ethanol) cồn 90%, VN , lít 50
- NaOCl 1-15%, TQ, lít 10
- Ca – hypochloride dạng bột, TQ , kg 10
- Clorua thuỷ ngân HgCl2, TQ, kg 2
- Tween 20 TQ , lít 10
- HCl 0,5%, TQ, 0.5 lít 10
- Xà Phòng, VN, kg 10
Những dung dịch khử trùng phổ biến dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Calcium hypocholorite TQ, kg 5
- Sodium hypocholorite TQ , lít 10
- Hydrogen peroxide TQ, lít 10
- Bromine water VN , lít 10
- Ethyl alcohol TQ , lít 10
- Silver nitrate TQ , kg 1
- Murcuric choloride TQ , kg 1
- Benzalkonium choloride, lít, Nhật bản 1
- Than hoạt tính, kg 20
2. Môi trường nuôi cấy (Mỹ/EU):
Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE) , 500g 2
Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH) India, 500g 2
CTAB, 100g 3
Tris-HCl, 100g 3
Tris-base, 100g 3
2xYT Medium - EZMix™ Powder microbial growth medium , 1kg 2
LB Broth with agar (Lennox) - EZMix™ powder microbial growth medium , 6 x 500ml 1
Nguồn cấp cac bon và năng lượng
D-(+)-Maltose monohydrate, 500g 2
D-(+)-Glucose , 100g 2
D-(+)-Mannose, 25g 2
D-Mannitol , 500g 2
Sucrose Grade I, plant cell culture tested , 1kg 1
Một số hỗn hợp dinh dưỡng: Bột chuối, nước dừa, Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền… 1
Amino axit
L-Arginine, from non-animal source, suitable for cell culture, 98.5-101.0% , 25g 2
L-Asparagine BioReagent, suitable for cell culture, 25g 2
L-Glutamine, cell culture tested, 99.0-101.0%, from non-animal source , 25g 2
Các chất dinh dưỡng đa lượng, loại dùng cho nuôi cấy thực vật
NH4NO3, 500g 2
KNO3, 500g 2
CaCl2.2H2O, 500g 2
MgSO4.7H2O, 500g 2
KH2PO4, 100g 2
(NH4)2SO4, 500g 2
NaH2PO4, 500g 2
Ca(NO3)2.4H2O, 500g 2
KCl, 500g 2
K2SO4, 1kg 1
Các chất dinh dưỡng vi lượng, loại dùng cho nuôi cấy thực vật
KI, 100g 3
H3BO3, 500g 2
MnSO4.xH2O, 500g 2
ZnSO4.7H2O, 500g 2
Na2MoO4.xH2O, 100g 3
CuSO4.5H2O, 250g 2
CoCl2.6H2O, 100g 3
Na2EDTA, 100g 3
FeSO4.7H2O, 500g 2
MnCl2.4H2O, 50g 5
Vitamin và các chất bổ sung khác
myo-Inositol BioReagent, suitable for plant cell culture , 100g 1
Glycine, for cell culture, 100g 2
Thiamine HCl, 1ml 1
Pyridoxine hydrochloride, BioReagent, suitable for plant cell culture , 25g 2
Nicotinic acid. suitable for plant cell culture, ≥98% , 100g 2
Cysteine HCl suitable for plant cell culture, 25g 1
Kháng sinh/ Antibiotic
Actinomycin D, ≥95%, for cell culture, 2mg 1
Ampicillin, power, for cell culture, 5g 1
Carbenicillin, plant cell culture test, 250g 1
Fosmidomycin, ≥95%, , 5mg 1
Kanamycin sulfate, plant cell culture test, 1g 1
Neomycin Sulfate, cell culture, 5g 1
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, for cell culture, 20ml 1
Polymyxin B sulfate salt, for cell culture, ≥6,000 USPunits/mg, 1MU 1
Streptomycin sulfate salt, powr, for cell culture, ≥720 I.U. per mg, 25g 1
3. Các chất điều hoà sinh trưởng (Mỹ/Châu Âu)
Auxin
- 1H- indole-3-acetic acid (IAA), gam, Trung Quốc 10
- 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 25g 1
- 1H-indole-3-butyric acid (IBA), gam 5
- 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 50g 1
- Naphthoxyacetic acid (NOA), 25g 1
- 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA), 25g 1
- 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 25g 1
- 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 100g 1
- Picloram plant cell culture tested, 10g 1
Cytokinin
- 6-benzylaminopurine (BAP), 25g 1
- 6-benzyladenin (BA), 5g 1
- 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), 50ml 1
- N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), 1 gam 1
- 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin), 5mg 1
Giberellin
- Gibberellic acid GA3, 1 gam 1
- Gibberllin 1 (GA1), 1 gam, Trung Quốc 1
- Gibberellin 4 (GA4), 5mg 1
Abscisic axít (ABA), 100mg 1
Jasmonic acid (Ja), 100mg 1
4. Các tác nhân làm rắn môi trường
- Agar, Việt Nam, kg 20
- Methocel, 100g, Châu Âu 5
- Alginate, Trung Quốc, kg 2
- Phytagel, 100g, Châu Âu 5
- Gel-rite, 250g, Châu Âu 4
VII. Các dụng cụ thí nghiệm bao gồm:
Bộ dụng cụ thủy tinh và vật tư tiêu hao cho phòng nuôi cấy tế bào thực vật
Bao gồm:
Pipette các loại:
+ Loại 2-20 ul 3
+ Loại 20-200 ul 3
+ Loại 100-1000 ul 3
+ Loại 1000-5000 ul 3
Đầu côn 10 µl , 1000 cái/túi 2
Đầu côn 200 µl , 1000 cái/túi 2
Đầu côn 1000 µl , 1000 cái/túi 2
Chai trung tính, GL 45 250ml 10
Chai trung tính, GL 45 500ml 10
Chai trung tính, GL 45 1000ml 10
Ống đong thủy tinh 10ml, class A 10
Ống đong thủy tinh 100ml, class A 10
Ống đong thủy tinh 1000ml, class A 10
Cốc đốt thấp thành 250ml 10
Cốc đốt thấp thành 600ml 10
Đĩa petri TT 90x15mm 100
Que gạt bằng thủy tinh dài 16cm 10
Ống nghiệm không vành 16x130mm, 17 ml thành dày có mark 100
Ống nghiệm không vành 18x180mm, 32ml, thành dày có mark 100
Giá ống nghiệm 20 và 18x100mm dạng cọng 50 lỗ, 3
Bình định mức, 12/21 50ml 0.06 A, nút nhựa 2
Bình định mức, 12/21 100ml 0.1 A, nút nhựa 2
Bình định mức, 14/23 250ml 0.15 A, nút nhựa 2
Bình định mức 19/26 500ml 0.25 A, nút nhựa 2
Bình định mức 24/29 1000ml 0.4 A, nút nhựa 2
Bình tam giác, cổ hẹp 250ml KT:34x145mm 100
Bình tam giác, cổ hẹp 500ml KT:34x180mm 100
Buret khóa PTFE 25ml, 1/20, loại AS 5
Buret khóa PTFE 50ml, 1/10, loại AS 5
Ống hút thẳng vạch nâu 1ml, AS , 0.01 10
Ống hút thẳng vạch nâu 2ml, AS , 0.01 10
Ống hút thẳng vạch nâu 5ml, AS , 0.01 10
Ống hút thẳng vạch nâu 10ml, AS , 0.01 5
Ống hút thẳng vạch nâu 25ml, AS , 0.1 5
Hộp lồng 100
Ống nghiệm có nắp 100
Các bình nuôi cấy bằng plastic có nắp 100
Đũa thuỷ tinh 10
Bộ dụng cụ kẹp cấy 20
Dao mổ 20
Que cấy vòng 20
Kim mũi nhọn 100
Giấy lọc 10
Bình đựng nước cất 10
Đèn cồn 10
Giá để dụng cụ 2 tâng 3
Cốc đựng cồn 10
Bông không thấm nước, kg 2
Bông thấm nước, kg 2
Nguồn: STECH INTERNATIONAL
